环化荧光蛋白生物探针的工作机理研究
发布日期:2021-03-01   作者:秦梦瑶   浏览次数:485

环化荧光蛋白探针是近年来快速发展的一类基因编码生物探针。它具有良好的生物兼容性,并且更易感受外界环境的变化,在生物检测方面具有重要的应用,所以引起了越来越多科学家的重视,现已发展成为一类非常重要的荧光蛋白生物探针,众多文章发表在CNS的主刊和子刊上。环化荧光蛋白探针通常是通过对荧光蛋白进行改造而获得,通过基因技术将荧光蛋白多肽序列原先开放的C端和N端封闭,在其发色团附近打开,并与感应蛋白融合从而获得环化荧光蛋白探针。因为它只有一个发光峰所以要求探针具有两个激发峰而且这两个激发峰的强度必须随检测物浓度具有相反的变化趋势,这对环化荧光蛋白的设计提出了极高的要求。

环化荧光蛋白探针与分析物分子结合以后,荧光蛋白发色团附近的微环境发生变化,导致了发射的荧光变化。因为环化荧光蛋白探针的三维晶体结构通常难以获得,而且荧光蛋白本身的发射就具有A态、B态、和I态等多种状态,并且可以通过蛋白突变来进行调控。这极大的增加了环化荧光蛋白发光动力学的研究难度,到目前为止,尚没有对环化荧光蛋白发光动力学的系统研究。

  我们首先通过时间分辨荧光光谱技术研究了环化荧光蛋白在结合和未结合分析物分子两个状态下的发光动力学。通过衰减相关荧光光谱(DAFS)和衰减相关激发光谱(DAES)研究了探针在结合分析物分子后其内部的基态(ABI态)及其激发态(A*、B*、I*)转化关系。我们提出基于稳态荧光强度的激发比率荧光探针的动态范围一定程度上是由A/(B+I)决定的,但是荧光寿命探针的动态范围是由I*/B*决定的。我们提出的模型在FHisJSoNarFrexiNap等多个环化荧光蛋白中获得了验证。本研究为设计基于荧光寿命的环化荧光蛋白探针提供了方向指导,相关成果发表在Sensors and Actuators B: Chemical 321, 128614 (2020)。我们课题组之前在此方面的系列研究发表在Analytical Chemistry 91 (6), 3869 (2019), Chinese Journal of Analytical chemistry 47 (1), 19009 (2019) Scientific Reports 7, 4209 (2017)上。

1.  (a)(b) FHisJ环化荧光蛋白探针在与分析物分子未结合(图a)和结合(图b)两个状态下的衰减相关激发光谱。(c)(d)分别为与(a)(b)对应的能级图。